Regulación positiva de la fosfodiesterasa tipo 5 en la próstata hiperplásica

Jul 27, 2023

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 17888 (2015) Citar este artículo

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Tanto la disfunción eréctil (DE) como los síntomas del tracto urinario inferior (STUI)/hiperplasia prostática benigna (HPB) son comunes en los hombres de edad avanzada. Numerosos ensayos clínicos han demostrado la eficacia y seguridad de los inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5-I) para el tratamiento de STUI/HPB con o sin DE. Sin embargo, nunca se ha estudiado la influencia de la BPH en la expresión de PDE5 prostática. Se desarrolló un modelo de HPB en ratas inducida por testosterona y se recolectaron muestras de próstata hiperplásica humana durante la cistoprostatectomía. Los subtipos de PDE5, nNOS, eNOS y α1-adrenorreceptor (α1aAR, α1bAR y α1dAR) se determinaron con RT-PCR en tiempo real para tejidos de rata, mientras que los subtipos de PDE5 y α1-adrenoreceptor se determinaron en muestras humanas. La PDE5 se analizó más a fondo mediante Western-blot y examen histológico. La testosterona sérica se midió con ELISA. Se validó que el modelo de BPH en ratas tenía una próstata significativamente agrandada. PDE5 localizada principalmente en el estroma fibromuscular de la próstata. Nuestros datos mostraron una regulación positiva significativa y previamente no documentada de PDE5 en BPH de ratas y humanas, junto con una mayor expresión de nNOS y α1dAR para tejidos de rata y α1aAR para BPH humana. La regulación positiva de la PDE5 en la próstata hiperplásica podría explicar el mecanismo y contribuir a la alta eficacia de los PDE5-I para el tratamiento de los STUI/HPB. El estroma fibromuscular podría ser el principal objetivo de los PDE5-I dentro de la próstata.

Los síntomas del tracto urinario inferior (STUI)/hiperplasia prostática benigna (HPB) son comunes en los hombres de edad avanzada. La prevalencia de HPB es aproximadamente del 40% en hombres de cincuenta años y alcanza el 90% en hombres de ochenta años o más1 y la incidencia de STUI es de alrededor del 25% en hombres de 50 años o más2. Este trastorno se caracteriza típicamente por agrandamiento de la próstata, constricción de la uretra y aparición de STUI. Además de la prostatectomía, los tratamientos farmacéuticos actuales para STUI/HPB tienen como objetivo aliviar los síntomas y ralentizar la progresión de la enfermedad. Las opciones de tratamiento médico oral actuales son 1) antagonistas de los receptores adrenérgicos α (bloqueadores α, AB) que reducen la resistencia uretral al atenuar la tensión de las fibras del músculo liso (SM) ubicadas en la próstata 2) inhibidores de la 5α-reductasa (5ARI) que están involucrados en el control hormonal del crecimiento de la próstata 3) antagonistas de los receptores muscarínicos (ARM) y 4) un “nuevo tratamiento emergente” inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5-Is)3,4. Varios estudios clínicos han demostrado la eficacia y seguridad de los PDE5-I en el tratamiento de STUI/HPB. Recientemente realizamos una revisión sistemática y un metanálisis en red que incluyó 64 ECA con 28196 participantes que compararon la efectividad de diferentes terapias con medicamentos orales para STUI/HPB5. Estos datos mostraron que entre todos los tratamientos farmacológicos, los PDE5-I combinados con AB obtuvieron el mayor puntaje en eficacia para disminuir la puntuación internacional de síntomas de próstata (IPSS), incluida la puntuación total, la subpuntuación de almacenamiento y la subpuntuación de micción. Los PDE5-I utilizados solos también mostraron una eficacia prometedora, con la excepción de no mejorar el caudal máximo (Qmax). Sin embargo, los mecanismos por los cuales PDE5-Is alivia los STUI/BPH siguen sin estar claros a pesar de la realización de varios estudios de ciencia básica. Estudios experimentales recientes informaron un papel funcional de la PDE5 en el tracto urinario inferior y sugirieron una posible importancia de la vía de señalización celular de PDE5-óxido nítrico (NO)/monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en el control de la SM urogenital6,7,8,9 . En el estudio actual utilizamos un modelo de BPH en rata y tejido prostático hiperplásico humano para investigar la expresión de genes implicados en las principales vías que regulan el tono SM, con énfasis en PDE5.

El modelo de HPB en ratas con suplementación de testosterona (T) se validó mediante un aumento del peso de la próstata ventral y la vesícula seminal (Fig. 1 y Tabla 1, P <0,001) en 1,6 y 2 veces, respectivamente. En consecuencia, se encontró que el nivel de T aumentó significativamente en los animales con BPH (Tabla 1, P = 0,016). El peso corporal de las ratas BPH disminuyó significativamente (Tabla 1, P <0,001), lo que puede atribuirse al efecto fisiológico de la T. No se encontró diferencia en el peso de la vejiga entre los 2 grupos (Tabla 1). El índice de próstata [peso húmedo de la próstata (mg)/peso corporal (g)] también se calculó observándose un aumento de 1,8 veces en el grupo de BPH (Tabla 1, P <0,001).

Fotografía típica de una rata con BPH y control. (a) vejiga, (b) próstata ventral, (c) vesícula seminal.

Se observó histopatología diferencial entre la BPH humana y la de rata mediante tinción con HE y tricrómico de Masson. Específicamente, en el modelo de BPH en ratas, la hiperplasia de la próstata se produjo principalmente en el epitelio, mientras que el componente estromal disminuyó (principalmente a través de la pérdida de fibras de colágeno, no de SM) (Figs. 2a, b y 3a). Por el contrario, en la muestra de BPH humana, tanto el estroma (principalmente a través del aumento de SM) como los epitelios aumentaron significativamente (a pesar de que hubo una pérdida de fibras de colágeno) (Figs. 2c, d y 3b).

Examen histológico de próstata.

Tinción tricrómica de Masson del tejido prostático. Las células SM prostáticas se tiñeron de rojo, las fibras de colágeno se tiñeron de azul y las células epiteliales se tiñeron de naranja. (a) Próstata de rata normal. (b) Próstata de rata BPH. La próstata hiperplásica se produjo principalmente en el compartimento epitelial y se observaron características típicas de hipertrofia glandular, incluido un aumento del número de acinos, las frondas papilares sobresalieron hacia las cavidades glandulares y la capa epitelial se engrosó. (aumento × 100). (c) Próstata humana normal. (d) Próstata humana con HPB. Se observó una evidente hiperplasia estromal. (aumento × 100, n = 8 para cada grupo).

Cuantificación histológica.

Porcentaje de área de diferentes componentes entre el grupo normal y el de BPH. El porcentaje de cada componente se cuantificó a partir de tres campos aleatorios de 100 × de cada corte de tejido (n = 8 de cada grupo) (a) próstata de rata. (b) próstata humana. Cajas, medias; barras, ± SEM; **P < 0,01 frente al control; *P < 0,05 frente al control.

Como se muestra en la Fig. 4, la inmunohistología demostró que la PDE5 estaba presente en la próstata de rata, predominantemente en las células del estroma fibromuscular y en las células endoteliales y SM de los vasos sanguíneos. La próstata humana también demostró inmunolocalización estromal de PDE5. Los controles negativos que omitieron el anticuerpo primario no se tiñeron y el control positivo que utilizó tejido pulmonar de rata y humano mostró una fuerte positividad inmune. Además, también se investigó la localización de nNOS en la próstata humana; nNOS estaba parcialmente colocalizada con PDE5 en la matriz estromal (Fig. 4).

Inmunolocalización de PDE5 y nNOS.

(a) Próstata de rata. Izquierda: PDE5 distribuida principalmente en el estroma fibromuscular (flechas negras), así como en las células endoteliales y del músculo liso de los vasos sanguíneos (triángulo negro). Medio: pulmón de rata como control positivo. Derecha: control negativo. (aumento ×200). (b) Próstata humana. Izquierda: la inmunofluorescencia Cy3 (rojo) indica la PDE5 que se observó abundantemente en el estroma fibromuscular. Medio: DAPI (azul) indica tinción nuclear. Derecha: imagen fusionada. (aumento ×200). (c) Doble marcaje por inmunofluorescencia de PDE5 y nNOS. Izquierda: la inmunofluorescencia Cy3 (rojo) indica PDE5. Medio: La inmunofluorescencia Cy2 (verde) indica nNOS. Derecha: la imagen fusionada indica la colocalización parcial de PDE5 y nNOS en el estroma fibromuscular. (aumento ×200). (d) Control negativo omitiendo el anticuerpo primario. (aumento ×200). (e) Se utilizó tejido pulmonar humano como control positivo para PDE5. (aumento ×200, n = 8 de cada grupo).

La expresión de ARNm de PDE5, nNOS, eNOS, α1aAR, α1bAR, α1dAR se determinó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real en el modelo de rata (Fig. 5). La BPH aumentó la expresión de PDE5 aproximadamente 2 veces a nivel genético (P = 0,001). La RT-PCR en tiempo real también mostró que la nNOS (P = 0,003) y los α1dAR (P <0,001) aumentaron significativamente en el grupo de BPH, pero sin cambios en el nivel de eNOS, α1aAR y α1bAR. La expresión de ARNm de PDE5, α1aAR, α1bAR y α1dAR también se determinó en próstata humana (Fig. 6). La BPH aumentó igualmente la expresión de PDE5 y α1aAR en 2,5 veces (P = 0,006, P = 0,02, respectivamente) sin cambios en la expresión de α1bAR y α1dAR.

Expresión de ARNm de PDE5, isoformas de óxido nítrico sintasa (nNOS y eNOS) y subtipos de receptores adrenérgicos α1 (α1aAR, α1bAR y α1dAR) en próstata ventral de rata (n = 15, 3 réplicas por experimento).

Cajas, medias; barras, ± SEM; **P < 0,01 frente al control; *P < 0,05 frente al control.

Expresión de ARNm de PDE5 y subtipos de receptores adrenérgicos α1 (α1aAR, α1bAR y α1dAR) en próstata humana (n = 9, 3 réplicas por experimento).

Cajas, medias; barras, ± SEM; **P < 0,01 frente al control; *P < 0,05 frente al control.

La expresión de la proteína PDE5 se cuantificó mediante análisis de transferencia Western (Fig. 7). Se detectaron dos bandas de proteínas principales con un peso molecular de 85 y 95 kDa, como se informó en nuestro estudio anterior10. Se encontró un aumento significativo de 1,8 veces y más de 3 veces de PDE5 a nivel de traducción para BPH de rata (P = 0,013) y humano (P <0,001), respectivamente.

Análisis de transferencia Western representativo y cuantificación densitométrica relativa de PDE5 en próstata humana y de rata.

( a ) Bandas representativas de transferencia Western de próstata de rata. ( b ) Bandas representativas de transferencia Western de próstata humana. Dos bandas específicas principales de los tamaños esperados (85 y 95 kDa, verde) son evidentes en todos los carriles; las bandas rojas indican los marcadores de proteínas. (c) Evaluación densitométrica de la expresión de PDE5 prostática de rata. ( d ) Evaluación densitométrica de la expresión de PDE5 prostática humana. La expresión de β-actina se analizó como control de carga, los resultados se expresan como proporción de PDE5 con respecto a β-actina (n = 10 para el grupo de ratas, n = 8 para el grupo de humanos, 3 réplicas por experimento). Cajas, medias; barras, ± SEM; *P < 0,05 frente al control, **P < 0,01 frente al control.

Nuestro modelo de rata con HPB inducida por T se validó mediante hiperplasia de la próstata y la vesícula seminal (órganos sensibles a los andrógenos) con un aumento significativo del peso de ambos órganos. Observamos una pérdida de peso corporal con la suplementación con T, que puede deberse a una mayor actividad diaria y a una mayor proporción de masa corporal magra/masa corporal grasa. En paralelo con observaciones anteriores11,12, la inyección de T condujo principalmente a una involución notable de la hiperplasia del epitelio acinar, como un aumento de la cantidad de acinos, hojas papilares que sobresalían hacia las cavidades glandulares y engrosamiento de la capa epitelial, mientras que el compartimento estromal estaba relativamente disminuido. La tinción con tricrómico de Masson cuantificó además que los epitelios de BPH aumentaron significativamente en comparación con el control, aunque el contenido de SM permaneció sin cambios. Por el contrario, en la condición humana se observó una hiperplasia estromal predominante con un aumento de SM de 2,2 veces.

Tanto en el tejido prostático de rata como en el humano, el gen y la proteína PDE5 se expresan altamente y se inmunodistribuyen exclusivamente en el estroma. Nuestro hallazgo está de acuerdo con Fibbi et al.6 en que la PDE5 se inmunolocalizó solo en el estroma fibromuscular y vascular (células endoteliales y SM) en la próstata de rata y humana sin inmunorreactividad en el área glandular. Sin embargo, contrasta con los hallazgos de Ückert et al.8 de que las áreas glandulares y subglandulares de la próstata humana también expresaban PDE5. Esta disparidad en la inmunolocalización de PDE5 podría atribuirse a los diferentes anticuerpos primarios empleados, así como a las diferentes fuentes de tejido. En el estudio de Fibbi et al., se obtuvo tejido prostático de pacientes con HPB, mientras que Ückert et al. El estudio obtuvo tejido de pacientes con cáncer de próstata. Sin embargo, Wang et al. Recientemente se descubrió que la PDE5 se expresaba tanto en el epitelio acinar como en el SM periacinar y en este estudio se observaron patrones de expresión de PDE5 específicos del lóbulo13. Especularon que tal expresión podría estar asociada con la función secretora glandular. La distribución predominante del estroma de PDE5 explicaría el papel funcional de los PDE5-I en el control de la SM prostática. En estudios de baños de órganos, nosotros y otros demostramos que la exposición de tejidos aislados de próstata humana o de rata a PDE5-I podría producir una relajación de las tiras prostáticas precontraídas10,14. Además, nuestro resultado del marcado doble inmunofluorescente de PDE5 y nNOS del presente estudio mostró que estas dos proteínas se colocalizan parcialmente en el estroma fibromuscular prostático, lo que brinda mayor apoyo para un papel funcional de PDE5-I en la relajación mediada por NO/cGMP del SM prostático.

Es importante destacar que nuestros datos demuestran por primera vez una mayor expresión del gen y la proteína PDE5 tanto en la próstata hiperplásica de rata como en humanos, observándose un aumento más significativo en la BPH humana que en la de rata. No realizamos la cuantificación de imágenes para inmunohistología de PDE5 ya que los resultados de la RT-PCR cuantitativa y la transferencia Western son más convincentes para la cuantificación. El aumento de la expresión de PDE5 puede estar asociado con un nivel elevado de T. Nuestros hallazgos en la próstata son ampliamente consistentes con otros tejidos del tracto urinario inferior (cuerpo cavernoso, vejiga y conducto deferente) en que la expresión de PDE5 está regulada por T15,16,17,18. En nuestro modelo de rata, después de 28 días de suplementación con T, ELISA detectó un aumento significativo en el nivel de T sérico. Para la HPB humana, es bien sabido que su desarrollo está estrechamente asociado con los andrógenos y la terapia antiandrógena con 5ARI es efectiva para próstatas más grandes de más de 40 ml, aunque el aumento de la relación estrógeno/T parece más importante para el desarrollo de la HPB19. En particular, se suponía que la dihidrotestosterona (DHT) desempeñaba un papel causal en la etiología de la HPB, aunque esta teoría sigue siendo especulativa y controvertida. Estudios anteriores20,21,22 informaron que los niveles de DHT intraprostática aumentaron, pero estos hallazgos no fueron confirmados por estudios posteriores23, probablemente debido a los diferentes métodos de recuperación de tejido, métodos de procesamiento de tejido y ensayos de determinación de andrógenos utilizados24. Además, la expresión elevada de PDE5 puede atribuirse a la hiperplasia estromal y al aumento del contenido de SM. Lin et al. informaron que el gen PDE5 no está regulado directamente por T y la disminución de la expresión de PDE5 en animales castrados se debe a un contenido reducido de SM25,26. De hecho, la BPH humana con predominio de estroma podría contribuir a una mayor expresión de PDE5 que la de la BPH de rata con predominio de epitelio, como se observó en nuestro estudio. Sin embargo, en nuestro modelo de rata, la cuantificación histológica mostró que el tejido conectivo disminuyó mientras que el contenido de SM permaneció sin cambios. Además, en nuestros estudios previos en un modelo de rata castrada10, la expresión de PDE5 disminuyó significativamente a pesar de un claro aumento relativo de la capa estromal observada. Por lo tanto, es más probable que el aumento de la expresión de PDE5 observado en nuestro estudio se relacione con un aumento de la expresión de genes y proteínas que con un cambio en la morfología.

La regulación positiva de la PDE5 en la próstata hiperplásica podría proporcionar una justificación para la alta eficacia de los PDE5-I para el tratamiento de pacientes con STUI/HPB con o sin DE. Es bien sabido que el agrandamiento de la próstata está relacionado con el envejecimiento2. En nuestro estudio, la próstata normal se obtuvo de hombres jóvenes con muerte cerebral con una edad promedio de 29 años, mientras que las muestras de BPH se obtuvieron de personas mayores con una edad promedio de 67 años. Las muestras incluidas en nuestro estudio podrían representar escenarios clínicos. No nos importaba la ubicación del tumor en la vejiga. Desde el primer ensayo clínico realizado por Sairam et al.27 en 2002 con sildenafil para el tratamiento de pacientes con STUI/HPB/DE, se han realizado muchos ensayos clínicos que demuestran la eficacia y seguridad de los I-PDE5 para el tratamiento de STUI/HPB. Nuestra reciente revisión sistemática y metanálisis en red5 mostraron que entre todos los tratamientos farmacológicos, los I-PDE5 combinados con AB obtuvieron el puntaje más alto en eficacia para aliviar la puntuación total del IPSS, la subpuntuación de almacenamiento y la subpuntuación de micción. Los PDE5-I solos también mostraron un efecto prometedor, excepto en Qmax. Aunque se han realizado una serie de investigaciones básicas, los mecanismos implicados en este tratamiento aún no están claros. Hasta la fecha, se ha llegado a un consenso de que los mecanismos potenciales de los PDE5-I en el tratamiento de los STUI/HPB son multifactoriales28: (1) relajación leve a moderada del tono muscular en la próstata y la vejiga; (2) Dilatación significativa de los vasos sanguíneos locales que proporcionan sangre adecuada; (3) Aumento significativo de la perfusión de oxígeno a los órganos locales; (4) Inhibición de la actividad nerviosa aferente de la vejiga; (5) brusquedad de la inflamación intraprostática; (6) Antiproliferación en próstata.

Además, se determinó en la próstata de rata la expresión de otros componentes moleculares implicados en vías asociadas con la contracción y relajación del SM prostático. Se descubrió que varios de estos genes estaban modulados diferencialmente por la BPH. En el modelo de rata, el ARNm de nNOS y α1dAR aumentó significativamente sin cambios para eNOS, α1aAR y α1bAR. Nuestra investigación de los subtipos de α1AR fue consistente con Kojima et al. estudio, aunque se utilizó un modelo de rata BPH diferente29. Además, Hampel et al. encontraron que en el tracto urinario inferior, la regulación positiva de los α1dAR se correlacionaba con una hipertrofia vesical grave y una obstrucción de la salida de la vejiga (BOO)30. Estos resultados sugirieron que los α1dAR pueden desempeñar un papel crucial en la BPH y el BOO de ratas. En humanos, los α1AR se expresan abundantemente en la próstata y la actividad excesiva de la contracción SM α1-adrenérgica parece ser una característica común de la HPB sintomática31. Además, la cuantificación previa de la expresión del ARNm de α1AR en la próstata humana ha revelado que predominan los α1aAR, seguidos de los α1dAR y los α1bAR32. Según se informa, este predominio de α1aAR es más marcado en la próstata hiperplásica. La inmunohistoquímica mostró que la inmunorreactividad para los α1aAR se localizaba exclusivamente en el estroma y consistentemente encontramos un aumento de 2,5 veces en la expresión de los α1aAR33,34. La expresión de α1bAR y α1dAR también se examinó en próstata humana y no se observó ninguna diferencia significativa. Esta discrepancia en la expresión del ARNm de los subtipos de adrenorreceptores α1 entre la BPH humana y la de ratas podría explicarse por diferencias en la morfometría del tejido. La expresión diferencial y el papel de las diferentes isoformas de NOS en la próstata y la HPB son interesantes y deberían definirse mediante más experimentación.

En el estudio actual, la inflamación casi siempre acompañó a la HPB. También sería interesante examinar más a fondo los factores inflamatorios en la próstata y explorar si la prostatitis podría afectar la expresión de PDE5 y la eficacia de sus inhibidores en pacientes con HPB/prostatitis. En conclusión, nuestros datos son el primer informe que demuestra un aumento de la expresión del gen PDE5 y de la proteína tanto en próstata hiperplásica de ratas como de humanos. Además, la regulación positiva de la PDE5 en la BPH mejoraría la eficacia de los PDE5-I dentro de la próstata y, por lo tanto, podría explicar el posible mecanismo y proporcionar la justificación para el uso de PDE5-I en el tratamiento de pacientes con STUI/BPH. Además, las células del estroma fibromuscular, así como las células endoteliales y SM de los vasos sanguíneos, podrían ser el principal tejido diana de los PDE5-I en la próstata.

Se utilizaron un total de 30 ratas Wistar macho de grado libre de patógenos específicos (SPF) (12 semanas), con un peso de 250 a 300 g. Las ratas se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se les alimentó con agua y comida para ratas ad libitum. Un grupo (n = 15) fue tratado con 0,1 ml de aceite de sésamo como control y al otro (n = 15) se le inyectó por vía subcutánea 2 mg/día de propionato de testosterona (Shanghai Tongyong Medical Co., Ltd, Shanghai, China) durante 28 días. . Las ratas se pesaron y se sacrificaron bajo anestesia utilizando una solución de eutanasia que contenía 10% [p/v] de hidrato de cloral el día 29. La sangre se recogió de la aorta abdominal. Se recogieron y pesaron todos los lóbulos prostáticos ventrales, las vesículas seminales y la vejiga. Se colocaron tiras prostáticas de 1 × 1 × 0,5 cm en formalina tamponada neutra al 10% [v/v] para examen histológico y otra porción de tiras se colocó en RNA Sample Protector (Takara Bio. Inc., Otsu, Shiga, Japón) para Análisis por PCR con el resto del tejido congelado en nitrógeno líquido y guardado a -80 °C. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron estrictamente de acuerdo con el cuidado y uso de animales de laboratorio (Consejo Nacional de Investigación, Washington, DC) y las regulaciones éticas relacionadas de nuestra universidad.

Se obtienen nueve muestras de próstata humana normal de hombres jóvenes con muerte cerebral (edad media, 29,1 ± 1,7 años) sometidos a una cirugía de donación de órganos. Se obtienen nueve muestras de BPH humana de pacientes (edad media, 67,7 ± 2,1 años) sometidos a cistoprostatectomía por cáncer de vejiga infiltrante sin infiltración de próstata y STUI/BPH. Inmediatamente después de la extracción, las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis. Todas las muestras de tejido se obtuvieron después de la aprobación del Comité Hospitalario de Investigación en Humanos y después de recibir el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes o sus familiares involucrados. El estudio en humanos se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

Después de recoger la sangre, se aisló el suero como fracción sobrenadante tras la centrifugación a 3000 g durante 10 minutos. La medición de las concentraciones de T se realizó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) según el protocolo de BlueGene Biotech (Shanghai, China).

El ARN total se aisló de los tejidos congelados utilizando el kit de extracción de ARN universal TaKaRa MiniBEST (Takara Bio. Inc., Otsu, Shiga, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se agregaron 100 ng de ARN en el sistema de reacción RT-PCR en tiempo real de un solo paso (Takara Bio. Inc., Otsu, Shiga, Japón). Todo el sistema se amplificó en una placa de 96 pocillos en un volumen de reacción de 25 μl y todas las muestras se procesaron por triplicado, utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (BioRad, EE. UU.). El protocolo experimental utilizado fue primero transcripción inversa (42 °C 5 min, 95 °C 10 s), seguido de un programa de amplificación repetido durante 40 ciclos (95 °C durante 5 s, luego 60 °C durante 30 s), utilizando SYBR. Medición verde. Para el tejido de próstata de rata, se amplificaron los siguientes objetivos: PDE5, NOS neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS) y subtipos de receptores adrenérgicos α1 (α1aAR, α1bAR y α1dAR) y para tejido humano, se investigaron PDE5, α1aAR, α1bAR y α1dAR. . Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2. Para la cuantificación relativa, la expresión génica se normalizó con la expresión del gen constitutivo de β-actina y se comparó mediante el método 2-ΔΔCT.

Las proteínas se extrajeron de muestras congeladas utilizando el kit de extracción CelLytic™ NuCLEAR™ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE. UU.) y se sometieron a electroforesis 100 μg de cada muestra en un gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS-PAGE) (Wuhan Boster Biological Technology Ltd, Wuhan, China) y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) utilizando un sistema de transferencia húmeda Bio-Rad. La membrana se bloqueó durante 2 h a temperatura ambiente con solución salina tamponada con Tris con Tween al 0,1% [v/v] (TBST) que contenía una solución de leche en polvo desnatada al 5% [p/v]. La membrana se incubó durante la noche con anticuerpo PDE5 primario (policlonal de conejo para PDE5A, ab64179) en una dilución de 1:1000 (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Las membranas se lavaron con TBST tres veces y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con una IgG anti-conejo de cabra conjugada con IRDye 800CW (LI-COR, Lincoln, EE. UU.) en diluciones de 1:15000. Después del lavado, las transferencias se visualizaron mediante escaneo con Li-Cor Odyssey Imager (Li-Cor, Lincoln, EE. UU.). Las bandas se cuantificaron mediante densitometría utilizando el software Li-Cor Odyssey. Se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo contra la β-actina (1:2000; Abcam) como control para determinar la carga equivalente.

Los tejidos de próstata humana y de rata fijados en formalina tamponada neutra al 10% [v/v] durante 24 a 36 h se procesaron de forma rutinaria para su inclusión en parafina. Las secciones de tejido incluidas en parafina (4 μM) se tiñeron con hematoxilina y eosina utilizando técnicas estándar. Las secciones de parafina se desparafinaron en xileno seguido de alcoholes graduados. Se añadió gota a gota solución de tinción compuesta Masson (Fuzhou Maxim Biotech Co., Ltd., Fuzhou, China) durante 10 minutos. Posteriormente, las secciones se lavaron con agua destilada, se diferenciaron en solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotungstico durante 10 minutos y se incubaron con solución de tinción azul durante 5 a 10 minutos. Se enjuagó brevemente en agua destilada y se diferenciaron en solución de ácido acético al 1% durante 2 minutos. Después de deshidratarlas rápidamente con alcohol al 95%, alcohol absoluto, las secciones se cementaron utilizando goma neutra para su observación. Usando este procedimiento, las células SM del estroma prostático se tiñeron de rojo, las fibras de colágeno se tiñeron de azul y las células epiteliales se tiñeron de naranja. En cada muestra, analizamos tres áreas con aumento (×100). El porcentaje de área de SM, fibras de colágeno y epitelio glandular se cuantificó con Image pro plus 5.0, respectivamente.

Las secciones para inmunohistoquímica se desparafinaron en xileno seguido de alcoholes graduados. La recuperación del antígeno se realizó en tampón citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) y se calentó a 96 °C durante 3 minutos. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó utilizando una solución de H2O2 al 3% [v/v] en metanol a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con suero de cabra normal al 15% [v/v] durante 1 hora a 37 °C para bloquear la unión no específica. Se aplicaron 100 µl de anticuerpo primario PDE5A adecuadamente diluido (1:100) a las secciones de los portaobjetos y se incubaron en una cámara humidificada a 4 °C durante la noche. Luego, las secciones se tiñeron mediante métodos inmunohistoquímicos de rutina. Se realizaron controles negativos para todas las muestras omitiendo los anticuerpos primarios. Se utilizó tejido de pulmón de rata como control positivo para la tinción con PDE5A. Se tomaron imágenes de todas las secciones teñidas utilizando el microscopio óptico Olympus-DP72 (Olympus, Japón).

La próstata humana se incrustó en el compuesto Tissue-Tec OCT (SakuraFinetek Japan, Tokio, Japón) y se congeló instantáneamente. Luego, el tejido se seccionó en rodajas de 10 μM de espesor y se descongeló, se montó en portaobjetos de vidrio usando un criostato (Leica CM 1850, Wetzlar, Alemania), se secó al aire y se fijó durante 10 minutos en acetona helada. Los portaobjetos se lavaron en PBS y luego se incubaron durante 2 h en una mezcla de PBS suplementada con Triton X-100 al 0,2% [v/v] y albúmina sérica bovina al 0,1% [p/v], seguido de incubación durante la noche con el anticuerpo primario ( policlonal de conejo para PDE5A, 1:100) y mezcla de anticuerpos del anticuerpo PDE5A (1:100) y policlonal de cabra para nNOS (1:50, Abcam, ab1376 Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos secundarios empleados para visualizar la localización de los dos anticuerpos primarios (Jackson ImmunoResearch Inc. West Grove, PA, EE. UU.) fueron IgG anti-conejo de cabra conjugada con Cy3 (1:1000) y IgG anti-cabra de burro conjugada con Cy2 (1:1000). :400). Se utilizó DAPI para teñir el núcleo. Se realizaron controles negativos para todas las muestras omitiendo los anticuerpos primarios. Se utilizó tejido pulmonar humano como control positivo para la tinción con PDE5A. La visualización se realizó con un microscopio láser (Olympus, Tokio, Japón). El análisis de colocalización se realizó utilizando NIS-Elements Viewer 3.20 (Nikon, Japón).

Todo el protocolo experimental fue aprobado por el comité de investigación de la Universidad de Wuhan.

Los resultados se expresan como media ± DE en la tabla y media ± SEM en el gráfico de barras. Se utilizó la prueba t de Student para analizar las diferencias entre dos grupos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v5.0 (La Jolla, CA). AP < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todos los procedimientos realizados en estudios con participantes humanos estuvieron de acuerdo con los estándares éticos del comité de investigación de la Universidad de Wuhan y los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio.

Todos los procedimientos realizados en estudios con animales se realizaron de acuerdo con el cuidado y uso de animales de laboratorio (Consejo Nacional de Investigación, Washington, DC) y los estándares éticos de la Universidad de Wuhan.

Todo el protocolo experimental fue aprobado por el comité de investigación de la Universidad de Wuhan.

Cómo citar este artículo: Zhang, W. et al. Regulación positiva de la fosfodiesterasa tipo 5 en la próstata hiperplásica. Ciencia. Rep. 5, 17888; doi: 10.1038/srep17888 (2015).

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Los autores agradecen al Dr. Kelvin P. Davies, profesor y director del Departamento de Urología e Instituto de Biología del Músculo Liso de la Facultad de Medicina Albert Einstein, por la revisión del manuscrito. Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N.81270843 y N.81160086).

Wenhao Zhang

Dirección actual: Departamento de Genética, Centro Médico de la Universidad Erasmus, Rotterdam, 3015 CN, Países Bajos

Zhang Wenhao y Zang Ning contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Urología, Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan, Wuhan, 430071, República Popular China

Wenhao Zhang, Ping Chen, Xinghuan Wang y Xinhua Zhang

Centro de Investigación Científica Médica de la Universidad Médica de Guangxi, Nanning, 530021, República Popular China

Ning Zang

Departamento de Urología, Primer Hospital Popular de Xiaochang, Hubei, 432900, República Popular China

Yao Ming Jiang

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WHZ, NZ y YMJ contribuyeron igualmente a este trabajo. WHZ, NZ y YMJ diseñaron el experimento y escribieron el primer borrador. PC y XHW recolectaron muestras de próstata humana. XHZ revisó críticamente los borradores del manuscrito, proporcionó importantes aportes intelectuales y aprobó la versión final para su publicación.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Zhang, W., Zang, N., Jiang, Y. et al. Regulación positiva de la fosfodiesterasa tipo 5 en la próstata hiperplásica. Representante científico 5, 17888 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17888

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Recibido: 20 de agosto de 2015

Aceptado: 09 de noviembre de 2015

Publicado: 10 de diciembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17888

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